Блоттинг

Блоттинг (от англ. "blot" - пятно) - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация.

Видеопротокол: блоттинг.


Методы разделения молекул для блоттинга:
  • электрофорез в полиакриламидном геле:
  •     o в денатурирующих условиях с добавлением мочевины - разделение коротких одноцепочечных НК;
        o в денатурирующих условиях с добавлением натрия додецилсульфата (электрофорез по Лэммли) - разделение белков по молекулярной массе;
        o в нативных условиях - разделение белков по трехмерной структуре;
  • изоэлектрофокусирование - для разделения белков по изоэлектрической точке (pI);
  • двумерный (2D) электрофорез - для разделения белков в двух направлениях - по изоэлектрической точке и по молекулярной массе;
  • электрофорез в агарозном геле - разделение НК:
  •     o по длине линейных фрагментов;
        o по "суперспирализации" кольцевых молекул;
  • тонкослойная хроматография - разделение липидов из липидных комплексов.

Методы переноса:
  • диффузия молекул - медленный перенос, часто применяется для липидов;
  • капиллярный блоттинг - мембрана прижимается к гелю, поверх нее кладется стопка фильтровальной бумаги, буфер для переноса увлажняет гель и поднимается под действием капиллярных сил, смачивая фильтровальную бумагу и перенося макромолекулы из геля на мембрану; капиллярный блоттинг может осуществляться:
  •     o в камерах с увлажнением геля буфером - "полусухим" переносом;
        o в камерах с погружением геля в буфер;
  • вакуумный блоттинг - аналогичен капиллярному блоттингу, но перенос ускоряется за счет использования вакуума вместо капиллярных сил, создаваемых при смачивании фильтровальной бумаги;
  • электроблоттинг - перенос заряженных макромолекул на мембрану происходит под действием электрического тока;
  • "пришивание" НК к мембране под действием УФ-облучения или нагрева - для окончательного закрепления на нейлоновых мембранах;
  • дот-блоттинг (слот-блоттинг) - нанесение образца производится в виде точки или черточки непосредственно на мембрану без предшествующего разделения молекул в геле или на ТСХ-пластине.

Типы мембран:
  • PVDF-мембраны (поливинилиденфторидные);
  • NC-мембраны (нитроцеллюлозные);
  • нейлоновые мембраны (применяются для НК).

Способы мечения и детекции макромолекул на мембране:
  • окрашивание - связывание красителя (ионов серебра, Кумасси, Понсо, этидия бромистого) непосредственно с детектируемыми макромолекулами;
  • иммунохимическое мечение - мечение макромолекул происходит за счет специфически связывающихся с ними меченых антител, детекция осуществляется:
  •     o иммуноокрашиванием - антитела метятся красителями, регистрируется поглощение света определенной длины волны;
        o иммуноферментно - антитела метятся ферментом, регистрируется количество окрашенного продукта, наработанного в ходе ферментативной реакции (ИФА);
        o хемилюминесцентно - антителя метятся репортерным ферментом, который в присутствии субстрата излучает свечение, регистрируется испускание света
            определенной длины волны;
        o флуоресцентно - антитела метятся флуоресцентной меткой, которая возбуждается светом определенной длины волны, регистрируется испускание света в
            более длинноволновой области;
  • радиационное мечение - в макромолекулы вводятся радиационные метки (радиоизотопы), детекция осуществляется с помощью:
  •     o авторадиографии (наложением на мембрану фотопленки);
        o радиоимаджинга (количественного определения радиационной эмиссии и построения картины взаимного расположения меток);
  • гибридизация - связывание нуклеиновых кислот мечеными олигонуклеотидами с комплементарной структурой, детекция, как правило, осуществляется регистрацией испускания радиационного излучения или флуоресценции метки;
  • масс-спектрометрия - используется для прямого структурного анализа липидов.

Принятые названия разновидностей блоттинга:
  • Саузерн-блоттинг (блоттинг по Саузерну) - по фамилии Эдвина Саузерна, предложившего метод - определение последовательности ДНК в образце и определение числа копий генов в геномной ДНК. Переносу на мембрану предшествует расщепление образца эндонуклеазами рестрикции на фрагменты и их фракционирование электрофорезом в агарозном геле. Анализ на мембране осуществляется гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами известной последовательности;
  • нозерн-блоттинг - определение последовательности РНК в образце и изучение генной экспрессии (определение мРНК). Аналогичен блоттингу по Саузерну, но исследуются выделенные из образца молекулы РНК, без расщепления эндонуклеазами. Разделение молекул проводят в агарозном геле с добавлением формальдегида (для денатурации РНК) или в полиакриламидном геле с добавлением мочевины (применяется для анализа микроРНК). Иммобилизация молекул РНК на мембране происходит за счет нагревания под вакуумом или "пришиванием" с помощью УФ-облучения;
  • вестерн-блоттинг - белковый иммуноблоттинг - аналитический метод, используемый для определения специфических белков в образце. Переносу на мембрану предшествует разделение белков в полиакриламидном геле. Анализ белков на мембране осуществляется иммунохимически;
  • фар-вестерн блоттинг - белковый блоттинг, используется для определения белок-белковых взаимодействий, аналогичен вестерн-блоттингу, но вместо антител используются другие белки, специфически связывающиеся с исследуемым белком;
  • соузвестерн-блоттинг - определение белков, связывающихся с ДНК, и сайтов в молекулах ДНК, с которыми связываются белки - аналогичен вестерн-блоттингу, но после денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле белки отмываются от натрия додецилсульфата в присутствии мочевины и за счет диффузии переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве пробы используют меченые фрагменты ДНК разной длины, полученные расщеплением более крупного исследуемого фрагмента геномной ДНК. Связавшиеся молекулы ДНК затем вымываются из каждого комплекса белок-ДНК и анализируются электрофорезом в полиакриламидном геле;
  • истерн-блоттинг - определение посттрансляционных модификаций белков (связанных с ними липидов, гликополисахаридов, фосфатных остатков) - аналогичен вестерн-блоттингу, но используются антитела не к белкам, а к липидам, гликополисахаридам и т.д. Также в качестве проб используются помимо антител другие белковые молекулы связывающиеся с исследуемыми (например, лектин);
  • фар-истерн-блоттинг - анализ липидов, разделенных высокоэффективной тонкослойной хроматографией. Перенос на мембрану, как правило, осуществляется за счет диффузии. Регистрация производится прямым масс-спектрометрическим структурным анализом.