Среды для культивирования клеток

1.jpg

Метод культивирования клеток и тканей находит применение в  биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, фармацевтике
и др. смежных областях. Клетки, ткани или органы выделяются из животных или растений и помещаются в искусственную
питательную среду для поддержания роста и/или пролиферации. Основными условиями, необходимыми для оптимального
роста клеток являются: контролируемый температурный режим, субстрат для прикрепления клеток (для адгезивных культур клеток),
подходящая культуральная среда, СО2-инкубатор для контроля уровня рН, поддержание осмотического давления. Наиболее важным
моментом для обеспечения оптимального роста/пролиферации клеток является выбор подходящей культуральной среды. Культуральная
среда представляет собой жидкость или гель, разработанная для поддержания роста/пролиферации клеток различного происхождения.
Среда для культивирования клеток состоит из определенного соотношения аминокислот, витаминов, солей, глюкозы, гормонов, факторов
прикрепления, факторов роста; поддерживает буферную систему и осмотическое давление.

Основные компоненты культуральной среды.

22.png
  








    

  • Компоненты, обеспечивающие буферную систему культуральной среды.
Культивируемые клетки сильно реагируют на изменение рН среды. Оптимальное значение рН для большинства клеток лежит в пределах 7,2-7,4. 
Бикарбонат натрия поддерживает «естественную» буферную систему культуральной среды (CO32- /HCO3-); требуя содержания 5-10 % СО
в атмосфере, что легко выполнимо при культивировании клеток в СО2-инкубаторе. 
ХЕПЕС представляет собой фосфатную соль с буферной емкостью в пределах 7,2-7,4 рН. Не требует контролируемой газовой среды, но в 
больших концентрациях может быть токсичен для некоторых типов клеток. 
Феноловый красный используется как индикатор рН: красный при рН 7,4 и меняет свой цвет до оранжевого или желтого при уменьшении 
значения рН. Для культивирования клеток, чувствительных к эстрогену рекомендуется использовать среду без фенола красного.

  • Соли
Неорганические соли поддерживают осмотическое давление в среде и помогают в регуляции мембранного потенциала, обеспечивая среду ионами натрия, калия и кальция. Осмоляльность среды 
так же важна, как уровень рН при культивировании клеток. Оптимальное значение осмоляльности лежит в пределах 260-340 мосмоль/кг в зависимости от типа культивируемых клеток. 
  • Аминокислоты
Аминокислоты являются строительным материалом для белков; незаменимые аминокислоты  всегда  входят в состав культуральной среды. Особенно важен L-глутамин; обеспечивает азотом НАД, 
НАДФН и нуклеотиды, являясь вторичным источником энергии для метаболизма клетки. Заменимые аминокислоты также иногда добавляются в культуральную среду. 
  • Углеводороды
Большинство сред включают в себя глюкозу и галактозу как источник энергии для клеток. 
  • Белки и пептиды
Наиболее часто используемыми белками и пептидами является альбумин, трансферрин и фибронектин; они особенно важны при бессывороточном культивировании. Альбумин связывает
воду, соли, гормоны и витамины и транспортирует их между клетками и тканями. Фибронектин играет ключевую роль в адгезии клеток. Трансферрин – белок-переносчик железа,
обеспечивающий железом клеточную мембрану.

  • Жиры и жирные кислоты

Особенно важны при бессывороточном культивировании, так как сыворотка обычно содержит их.

3.jpg
 4.jpg
  • Витамины
Многие витамины необходимы для клеточного роста и пролиферации. В культуральную среду обычно добавляют рибофлавин, тиамин и биотин.
  • Добавки
Наиболее важным компонентом культуральной среды является сыворотка; она добавляется перед применением,  примерно 5-10 %. Сыворотка представляет собой смесь
альбуминов, факторов роста и ингибиторов роста;  является источником витаминов, аминокислот, белков, углеводородов, жиров, микроэлементов, факторов роста. Наиболее часто
используют бычью и телячью эмбриональную сыворотку. Факторы роста, цитокины, гормоны добавляются в культуральную среду для пролиферации и активации клеток.
Антибиотики добавляются для предотвращения контаминации культуральной среды бактериями и грибами; однако антибиотики не предотвращают заражение культуральной среды микоплазмой.

Выбор культуральной среды.



Среда MEM (Minimum Essential Medium),  или среда Игла была разработана Гари Иглом и является наиболее распространенной средой для культивирования клеток
наряду со средой DMEM. Среда МЕМ содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. Есть модификации
среды МЕМ с солями Эрла и Хэнкса, а также α-модификация  среды MEM с содержанием всех 21 аминокислот и солями Эрла.
Среда DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) является модификацией среды BME (Basal Medium Eagle) и содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, а также
различные добавки, улучшающие рост клеток. Изначально среда DMEM была с содержанием глюкозы 1г/л и применялась для культивирования эмбриональных клеток мыши. Затем
появились модификации среды  DMEM (с высоким и пониженным содержанием глюкозы, пирувата натрия, различных добавок) для культивирования клеток различных типов, в том числе
нетрансформированных клеток и гибридом. Среда DMEM является наиболее распространенной средой для культивирования клеток наряду со средой MEM.
 5.jpg
Среда DMEM/F-12  в соотношении 1:1 применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур. Изначально среда F12 была разработана для бессывороточного культивирования
СНО клеток, клеток легких и мышиных L-клеток. В связи с богатым содержанием питательных веществ в среду DMEM/F12  можно добавлять относительно  небольшое количество эмбриональной
бычьей сыворотки (FBS–fetal bovine serum), либо использовать без сыворотки, но тогда необходимо добавлять такие факторы,  как инсулин, трансферин,  эпидермиальный фактор роста и др..
Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute (откуда и берет свое название) в 1966 Муром и его коллегами для культивирования лейкоцитов. В настоящее время используется для
широкого спектра клеточных культур.
Среда IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) - это модификация среды DMEM, содержащая селенит натрия, добавочные аминокислоты и витамины, пируват натрия, ХЕПЕС и нитрат калия вместо
нитрата железа. Среда IMDM используется для  поддержания культуры клеток В лимфоцитов, В клеток, стимулированных  полисахаридами, Т лимфоцитов и гибридом.
Среда 199 первоначально была разработана для поддержания культуры первичных эксплантов. В настоящее время среда 199 применяется для продукции вакцин, культивирования первичных эксплантов и
тканей хрусталика. Изначально среда 199 готовилась с солями Эрла, но есть модификация среды 199 с солями Хэнкса.
Среды F-12 и F-10 изначально были разработаны Хэмом (Ham′s nutrient mixture) для культивирования СНО клеток, HeLa и мышиных L-клеток. Обе среды были разработаны для бессывороточного культивирования.
Среда F-12 применяется для культивирования широкого спектра клеток млекопитающих и гибридом.
Среда Грейса (Grace’s Insect Media) применяется для поддержания клеточных линий, полученных от бабочек и некоторых двукрылых.
Среда Шнейдера (Schneider’s Insect Media) изначально разрабатывалась для дрозофилы, но может применяться и для поддержания клеточной культуры других двукрылых.
Соли Хэнкса (Hanks’ Balanced Salt) изначально были разработаны для поддержания культуры клеток в атмосфере без СО2. Для диссоциации клеток применяются соли Хэнкса без ионов кальция и магния.
Соли Эрла (Earle’s Balanced Salts) применяются для суспензионных культур, а также при проблеме слипания клеток.
Буфер фосфатный  Дульбекко применяется для промывки клеток. Кальций и магний способствуют слипанию клеток; фосфатный буфер без кальция и магния используют для суспензионных культур.

                                                                                           6.png